英  文  名：25-Hydroxyvitamin D3 (HVD3) ELISA Kit

中  文  名：25-羟基维生素D3(HVD3)ELISA试剂盒

货       号：CEA915Ge

适用生物：通用

预期应用: HVD3 ELISA试剂盒运用竞争抑制ELISA 法定量测定血清、血浆或其它相关生物液体中HVD3 含量。

试剂准备:

1、使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25oC)，试剂不能直接在37oC 溶解。
2、标准品(冻干品)：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，盖好后室温静置大约10 分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200ng/mL。准备5 个稀释标准品的EP 管，每个EP 管中加入600μL 的标准品稀释液，如图所示依次三倍稀释成200ng/mL, 66.67ng/mL, 22.22ng/mL, 7.41ng/mL, 2.47ng/mL，标准品稀释液(0ng/mL)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

3、检测溶液A 及检测溶液B：Detection A 及Detection B 在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液A 或B1:100 稀释(如：10μL 检测溶液A/990μL 检测稀释液A)，充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(50μL/孔)，实际配制时应多配制0.1-0.2mL。
4、浓洗涤液：用580mL 蒸馏水或去离子水将20mL 浓洗涤液稀释至600mL，进行30 倍稀释。
5、底物溶液：请用灭菌的移液器吸头吸取所需体积的TMB 至另一干净容器中使用，容器中剩余的底物应予丢弃，不要倒回TMB 瓶中。

注意：
1、标准品的稀释不能直接在板中进行。
2、标准品请于临用前15 分钟内配制。该标准品只能使用一次。
3、标准品、检测溶液A 工作液、检测溶液B 工作液请使用相应的稀释液配制，不能混淆。混匀时要轻轻充分混匀，避免起泡。为保证实验结果的准确请使用微量吸管，并校准微量加液器。请依据所需的量精确配制，尽量不要微量配制(如吸取检测溶液A 时，一次不要小于10μL)，以避免造成浓度误差。
4、请勿重复使用已经稀释过的标准品、检测溶液A 工作液和检测溶液B 工作液。
5、浓洗涤液中如有结晶析出，请先温育至室温，轻轻混匀，至到结晶完全溶解再进行配制。

6、试剂盒中部分试剂为储存液，客户需配置成工作液后使用，在配置过程中如因纯净水质量差或水质污染，以及实验中所用耗材洁净度差，可能造成实验结果不准确，甚至完全错误，请使用双蒸水。

操作步骤:

1、加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔5 孔，依次加入50μL 不同浓度的标准品(见试剂准备2)。空白孔加50μL(见试剂准备第二步最后一管)，余孔加待测样品50μL，然后立即每孔加检测溶液A工作液50μL，轻轻振动，混匀，注意不要有气泡，酶标板加上覆膜，37oC 温育1 小时。
2、弃去孔内液体，每孔用350μL 的洗涤液洗涤，浸泡1-2 分钟，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次(也可轻拍将孔内液体拍干)，重复洗板3 次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。自动洗板机亦可。
3、每孔加检测溶液B 工作液(临用前配制)100μL，加上覆膜，37oC 温育30 分钟。
4、弃去孔内液体，甩干，洗板5 次，方法同步骤2。
5、每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37oC 避光显色(反应时间控制在15-25 分钟，不要超过30 分钟。当标准孔的后面3 孔有明显的梯度蓝色，前3 孔梯度不明显时，即可终止)。
6、每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。
7、在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm 波长测量各孔的光密度(O.D.值)。

实验原理:

       25-羟基维生素D3（HVD3)ELISA试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定标本中待测物质水平。将HVD3 单克隆抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗体的微孔中同时加入生物素标记的HVD3 类似物和待测抗原(标准品或样本)，待测抗原与生物素标记HVD3 类似物对特异性抗体进行竞争结合。温育后经洗涤去掉未结合物，然后加入HRP 标记的亲和素，经过温
育和彻底洗涤后加入底物TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
待测标本浓度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅。显色的深浅与酶量呈正相关，而与样品中
待测物质含量呈负相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（O.D.值），计算样品浓度。

计     算:

       本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法，所以样本中HVD3 的含量与其显色呈负相关，HVD3 的含量越高，显色越浅，
含量越低，显色越深。
       用标准品及样本O.D.值作图（五点图），如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标（对数坐标），O.D.值为横坐标，在半对数坐标纸上（或使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.30）绘出标准曲线（最佳方程式应依回归方程计算的R2 值来定，以R2 值越趋近于1 为好）。根据样品O.D.值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与O.D.值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的O.D.值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

典型数据:

       为了便于计算，尽管浓度为自变量而O.D.值为因变量，我们绘图时仍采用标准品的O.D.值作为横坐标(X 轴)，取标准品浓度的对数为纵坐标(Y 轴)。由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和温度条件等），标准曲线的O.D.值会有所差异。所提供的标准曲线仅供参考，实验者需要根据自已的实验建立标准曲线。

检测范围:   2.47ng/mL-200ng/mL

最低检测限:  0.91ng/mL (此值为20 个空白样品(即标准品稀释液)测定的平均值减二倍标准差所对应的浓度。)

特异性:

本试剂盒用于检测HVD3，经检测与其它相似物质存在一定交叉反应。
由于受到技术及样本来源的限制，不可能完成对所有相关或相似物质交叉反应检测，因此本试剂盒有可能与未经检测的其它物质有交叉反应。

回收率:

分别于定值血清及血浆样本中加入一定量的HVD3（加标样品），重复测定并计算其均值，回收率为测定值与理论值的比率。

线   性:

在定值血清及血浆样本内加入适量的HVD3，并倍比稀释成1:2，1:4，1:8，1:16 的待测样本，线性范围即为稀释后样本中HVD3 含量的测定值与理论值的比率。

精密度:

精密度用样品测定值的变异系数CV 表示。CV(%) = SD/mean×100
批内差：取同批次试剂盒对低、中、高值定值样本进行定量检测,每份样本连续测定20 次，分别计算不同浓度样本的平均值及SD 值。
批间差：选取3 个不同批次的试剂盒分别对低、中、高值定值样本进行定量测定，每个样本使用同一试剂盒重复测定8 次，分别计算不同浓度样本的平均值及SD 值。
批内差： CV<10%
批间差： CV<12%

稳定性:

经测定，试剂盒在有效期内按推荐温度保存，其活性降低率小于5%。
为减小外部因素对试剂盒破坏前后检测值的影响，实验室的环境条件需尽量保持一致，尤其是实验室内温度、湿度及温育条件。其次由同一实验员来进行操作可减少人为误差。

参考文献：