产品货号：CEB526Ge

适用生物：通用

实验原理：本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定标本中待测物质水平。将LPS 单克隆抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗体的微孔中同时加入生物素标记的抗原和待测抗原(标准品或样本)，待测抗原与生物素标记抗原对特异性抗体进行竞争结合。温育后经洗涤去掉未结合物，然后加入HRP 标记的亲和素，经过温育和彻底洗涤后加入底物TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。待测标本浓度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅。显色的深浅与酶量呈正相关，而与样品中待测物质含量呈负相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（O.D.值），计算样品浓度。

预期应用：本试剂盒运用竞争抑制ELISA 法定量测定血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清或其它相关生物液体中LPS 含量。

操作步骤：

1、加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔5 孔，依次加入50μL 不同浓度的标准品(见试剂准备2)。空白孔加50μL(见试剂准备第二步最后一管)，余孔加待测样品50μL，然后立即每孔加检测溶液A工作液50μL，轻轻振动，混匀，注意不要有气泡，酶标板加上覆膜，37oC 温育1 小时。
2、弃去孔内液体，每孔用350μL 的洗涤液洗涤，浸泡1-2 分钟，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次(也可轻拍将孔内液体拍干)，重复洗板3 次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。自动洗板机亦可。
3、每孔加检测溶液B 工作液(临用前配制)100μL，加上覆膜，37oC 温育30 分钟。
4、弃去孔内液体，甩干，洗板5 次，方法同步骤2。
5、每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37oC 避光显色(反应时间控制在15-25 分钟，不要超过30 分钟。当标准孔的后面3 孔有明显的梯度蓝色，前3 孔梯度不明显时，即可终止)。

6、每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。
7、在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm 波长测量各孔的光密度(O.D.值)。

标本的采集与保存：
1、血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2 小时或4oC 过夜，然后1000×g 离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20oC 或-80oC 保存，但应避免反复冻融。
2、血浆：用EDTA 或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30 分钟内于2-8oC 1000×g 离心15 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20oC 或-80oC 保存，但应避免反复冻融。
3、组织匀浆：
1） 取适量组织块，于预冷PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，称重后备用（组织块较大需先剪碎后再匀浆）；
2） 可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果：首先将组织块移入玻璃匀浆器，加入5-10mL 预冷PBS 进行充分研磨，该过程需在冰上进行（有条件实验室可选用机器匀浆）；得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理（超声破碎过程中注意冰浴降温；反复冻融法可重复2 次）。
3） 将制备好的匀浆液于5000×g 离心5 分钟，留取上清即可检测。
4、细胞裂解液：
1）贴壁细胞需要先用胰酶消化，离心收集细胞（悬浮细胞可直接离心收集）；
2）将收集到的细胞用冷PBS 洗3 次；
3）物理方法裂解细胞（可先超声破碎细胞，再反复冻融）：
i 超声破碎：取适量PBS 重悬细胞，用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。
ii 反复冻融：将待破碎的细胞在-20oC 以下冰冻，室温融解，反复3 次，使细胞溶胀破碎。
4）将标本于2-8oC 1500×g 离心10 分钟，收集上清备用。
5、细胞培养上清或其它生物标本：请1000×g 离心20 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20oC 或-80oC 保存，但应避免反复冻融。

注意事项：
1、以上标本均需密封保存，4oC 保存应小于1 周，-20oC 不应超过1 个月，-80oC 不应超过2 个月。
2、标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
3、标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。试剂准备

计算：

本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法，所以样本中LPS 的含量与其显色呈负相关，LPS 的含量越高，显色越浅，含量越低，显色越深。
用标准品及样本O.D.值作图（五点图），如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标（对数坐标），O.D.值为横坐标，在半对数坐标纸上（或使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.30）绘出标准曲线（最佳方程式应依回归方程计算的R2 值来定，以R2 值越趋近于1 为好）。根据样品O.D.值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与O.D.值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的O.D.值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

典型数据：

为了便于计算，尽管浓度为自变量而O.D.值为因变量，我们绘图时仍采用标准品的O.D.值作为横坐标(X 轴)，取标准品浓度的对数为纵坐标(Y 轴)。由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和温度条件等），标准曲线的O.D.值会有所差异。所提供的标准曲线仅供参考，实验者需要根据自已的实验建立标准曲线。